隨著生物分子在許多制藥公司藥物開發途徑中所占據的比例越來越大，人們越來越關心相關開發、生產與監管方面難題的解決。由于藥物的潛在免疫原性是生產商和監管者都十分關心的要素，因此如何定義生物藥品的純度與效力要比那些小分子藥物復雜得多。這反過來突顯了業界對高質量分析工具的迫切需要——希望它們能有助于全面表征出生物藥物顆粒和團聚物，同時對藥物內在顆粒與污染物的理化特性表征也越來越重視。
測量的用處何在？
藥物分子從發現走向早期配方是十分關鍵的一個步驟。分子的理化特性是藥物配方與給藥的決定因素；藥物分子的理化特性確定得越早，就能獲得越大的經濟效益——無論是為了確定上述步驟成功的可能性，還是盡早避免可能的失敗。就這一點而言，比較理想的是能夠在非常少量的樣品上進行一系列非破壞性試驗，并且把更多的精力放在改善可能用到的測試過程中。
從藥物分子理化特性表征到藥物開發過程直至最終的成品測試，發現和檢測蛋白質團聚物，是藥物開發最重要的步驟，因為理解藥物分子這方面的行為對于藥物產品的配制、穩定性和安全性來說都是至關重要的。蛋白質結構是通過范德華力、氫鍵、二硫鍵和疏水作用的結合來保持的，環境條件的改變可能會影響其中的一些或者全部相互作用力——其結果可能會引發團聚物非正常的折疊或者對于溶解性造成負面影響。在此過程中，蛋白質的活性常常會消失，也有可能很多團聚物會發展出免疫原性，從而對最終治療藥物產品的有效性和安全性造成顯著影響。
當前的監管預期是，對團聚物和大小范圍在“0.2- 2”微米級別1的不溶性微粒進行表征。大小超過幾微米的團聚物可以用視覺方法來進行表征。小于這個尺寸的，可以采用動態光散射(DLS) 法和體積排除色譜 (SEC) 法等成熟的分析技術對蛋白質凝聚物進行表征。圖1列出了上述方法所采用的技術和測量范圍。共振質量測量法 (RMM)是最新發展的技術現在也被用來檢測和統計50 nm到5μm這一至關重要尺寸范圍內的不溶性微粒，并對它們的浮力質量、凈質量和粒徑大小進行可靠的測量。共振質量測量法為不溶性微粒和亞微米級凝聚物提供了測量窗口。
動態光散射法的使用
動態光散射法測量迅速，屬于非侵入性的測量方式，特別適合在藥物試劑開發的早期階段篩選蛋白質。該技術測量了布朗運動下的蛋白質所產生的散射光強度波動，并將結果轉化為尺寸與尺寸分布數據。這種技術最大的優點之一是能夠在最早的階段對蛋白質團聚物進行檢測，從而確定生成或者阻止蛋白質形成團聚物的條件。
蛋白質分析過程應該選擇理想的動態光散射（DLS）技術。當溶液中蛋白質尺寸與散射光波長相比非常小時，散射光的強度不再取決于角度，也就是說從任何角度進行測量都會得出相同的結果。然而隨著蛋白質尺寸增大并超過≈λ/ 10時，向前的散射光強度開始增加，此時，從合適的角度對數據進行收集就變得十分重要。例如，采用配有背向散射檢測技術的儀器，通過測量前后兩個方向 (見下列數據)的散射光強可以對蛋白質團聚過程進行有效的監控。
應用體積排除色譜法
體積排除色譜法 (SEC)，顧名思義，是利用分子在流體力學尺寸上的差異分離溶解的高分子。通常在生物科學實驗室會采用這種方法來表征純化和重組的蛋白質。當使用SEC作為分析工具時，其得到的信息量和有效性取決于和色譜連接的檢測技術。
單檢測SEC采用紫外 (UV) 檢測儀來檢測濃度，依然是測試所有蛋白質團聚物的傳統手段，但是功能更為強大的多檢測系統在這個應用領域越來越受到人們的青睞，因為它們可以提供互補的信息和對檢測結果綜合解釋。例如，結合了示差折光檢測器(RI) 、紫外檢測器、光散射檢測器和粘度檢測器的系統可以對蛋白質樣品進行全面表征，提供分子量數據以及詳細的結構變化和特征，同時避免了色譜柱校準的需要。
圖3顯示了GPC /SEC色譜儀對牛血清蛋白樣本的檢測，上面顯示了由RI和光散射檢測器組成的系統所獲得的響應。紅色為RI信號，在大約25毫升時反應比較明顯，根據相應光散射強度數據 (綠色) 計算得到的分子量，可以確定是單體。較早出現的兩個流出峰，根據分子量可以確定為二聚體和三聚體。最早出現的峰值處所對應的大量光散射信號表明，這些是團聚物。如果僅僅依靠單個RI/UV檢測器系統是對于所有組成進行準確的定性定量的檢測是不可能完成的。
引入共振質量法測量
作為分析家族中相對較新的一員，共振質量檢測方法 (RMM) 檢測并統計樣本中不溶性微粒與亞微米級微粒的數量，同時測量其粒度尺寸和質量分布。由于RMM 是一種計數技術，上述質量分布數據是在數字基礎上產生，因此賦予該技術對稀疏顆粒群很好的敏感性。
在共振質量檢測儀的核心部位，有一個微機電系統 (MEMS) 傳感器，傳感器內含有微米級流通道的共振懸臂。當粒徑范圍為50 nm - 5μm的單個顆粒流過通道時，懸臂的諧振頻率會發生與顆粒浮力質量相對應的變化，由此可以從檢測到的頻率變化中推斷出顆粒的干燥質量和粒徑。
與此同時，MEMS傳感器還能提供關于樣本濃度、粘度、密度和體積等信息，并能夠檢測和分辨相對于溶劑的正負浮力的顆粒。基于浮力正負的區分能力非常有用，比如他可以同時區分檢測被硅油液滴污染的樣品中的硅油成分和蛋白質成分 (見圖4)。這是一個在藥物開發后期和生產中經常會碰到的問題，因為在上述場合中硅油是藥物輸送的注射器經常遇到的一種污染物。
共振質量檢測法的另一個優點是，那就是它架起了可見光法和溶液法 (如體積排除色譜法，較難測出蛋白質團聚成都) 之間的橋梁。監管機構十分希望能對蛋白質的團聚物加以可靠的量化和全面的認識，為了滿足上述的分析需求，共振質譜法技術應運而生，它可以貫穿質量控制的整個過程，甚至在有常見污染物的情況下也能滿足分析需求。
展望未來
生物分子固有的復雜性和可變性對快速發展的生物制藥行業提出了諸多新挑戰。利用現有技術對成品中的蛋白質顆?；驁F聚物進行檢測固然十分重要，但業界越來越需要各種有助于了解促進上述相互作用的理化機制、并對穩定配方的開發起到支撐作用的測量技術。分析解決方案提供商必須跟上這樣的變化步伐，憑借側重于測量全新而又不斷出現的“品質屬性”的儀器產品的快速開發，對行業需求作出預見和響應。
參考資料
1 演講稿：Susan Kirshner，FDA 生物技術辦公室。下載地址：點擊下載
結語
位于美國賓夕法尼亞州的馬爾文儀器最近推出了一項全球生物科學發展項目。這是一個資源充足并且專注于高端技術合作開發的項目，與許多生物制藥公司和該領域內聲名卓著的學術領導人合作。下面的方框里包含了項目的更多細節，如需進一步了解敬請與我們接洽。
圖1:業界需要一系列分析技術，確保對蛋白質凝聚物所有可能的粒徑范圍進行準確測量
圖2: 對后方(173 度)和前方(12.8 度)的光散射強度同時進行測量，確保整個凝聚過程中的粒徑得到準確的測量。
圖3: 采用由RI 和光散射檢測儀組成的GPC/SEC 系統對牛血清蛋白進行測量。
圖4: 共振質譜法(阿基米德，馬爾文儀器)對單個蛋白樣品進行了正浮力硅油液滴和負浮力蛋白質凝聚顆粒兩種尺
寸分布進行測量。
（作者：Stephen Ball,，馬爾文儀器產品營銷經理）
