引言
一提到分子診斷,人們自然會想到核酸和基因。的確,分子診斷技術的發展與分子生物學的研究是分不開的,自1953年Watson和Crick發現DNA雙螺旋結構以來,一系列分子生物學新技術相繼出現,如Sanger測序、放射性核素和非放射性核素標記技術、電泳、層析、核酸純化、核酸液相和固相雜交、基因工程技術、限制性酶切、聚合酶鏈反應(PCR)技術、毛細管電泳、實時熒光PCR、基因芯片、質譜、新一代測序等。這些技術為臨床分子診斷手段的發展提供了源源不斷的動力和無限的想象空間,并在應用中不斷地成熟,使得臨床分子診斷成為檢驗醫學最有活力一個的領域,是當今個體化醫療迅速發展的支撐,其具體表現形式就是各種用于特定疾病診斷和治療的臨床分子診斷試劑。
一、歷史
我國的臨床分子診斷試劑的出現,最早可以回溯到上世紀80年代,較國外晚10年左右,當時國外主要用于遺傳病的診斷,我國則主要用于乙型肝炎等傳染病的檢測,這與我國人群乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染率高,乙型肝炎患者較多是分不開的。那時,主要是采用硝酸纖維素膜上斑點雜交方法,探針采用32P標記,雜交完成后,通過放射自顯影顯示結果,后來,逐步發展到采用生物素或地高辛等非同位素標記。上世紀90年代以前,在我國涉及乙型肝炎治療的醫院臨床實驗室應用核酸斑點雜交檢測HBV DNA相當普遍。斑點雜交技術的特點是簡單方便,但檢測敏感性低,今天看來,將其用于對檢測靈敏度要求較高的病原體的檢測并不合適。1983年,美國Cetus公司的Mullis發明了PCR技術,其利用DNA高溫變性和低溫復性的基本原理,通過變性、復性和延伸3個溫度變化,成功實現了DNA在體外的復制。但該技術最初由于每一擴增循環均需加入DNA聚合酶(因其不耐熱),實際應用受到限制,成為PCR應用于疾病診斷的瓶頸,隨后幾年,該公司成功從美國黃石國家公園溫泉中分離到的嗜熱菌中得到了耐熱的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶),1989年被美國Science雜志命名第一個“年度分子”使PCR臨床應用的瓶頸問題迎刃而解,從而使得PCR成為臨床分子診斷和生命科學研究中的一個革命性技術,預示著分子時代的到來。因此到90年代初期,國內一批研究人員迅即將這一技術用于HBV的臨床檢測,出現一大批生產PCR試劑的公司,采用的基本技術是PCR-瓊脂糖凝膠電泳方法,靶核酸經PCR擴增后,會出現一定長度片段的特異擴增產物,電泳分離后,經溴化乙啶染色,紫外線下可見相應的分子大小的條帶。到90年代中期,又有一些廠家,生產了PCR-板上雜交即PCR-酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法。但由于PCR-瓊脂糖凝膠電泳和PCR-ELISA均為PCR后有一個開管取擴增產物進行分析的過程,極容易出現擴增產物被“污染”所致的假陽性結果,臨床反映強烈,直接導致1998年4月衛生部下文暫停了PCR檢驗在臨床中的應用。其實在90年代中期,國內一些企業已意識到這種假陽性帶來的問題,開始研發實時熒光PCR檢測試劑,并用于臨床檢測。
二、現狀及問題
臨床檢驗的發展方向無疑是自動化,臨床分子診斷亦是如此。自動化帶來了“檢測系統”的概念,即檢測儀器、試劑和校準品的一體化,從而避免了同一試劑在不同實驗室配不同儀器所帶來的結果不確定的問題,但由于我國整體工業水平(尤其是原材料工業和精密加工工業)與西方發達國家的差距,在國產儀器設備的基礎實現臨床檢驗的自動化尚需時日,臨床分子診斷尤甚。因此,目前我國的臨床分子診斷在核酸提取、擴增反應液準備、擴增前加樣、上機、產物分析和結果分析報告等方面仍是以手工操作為主。
分子診斷中繁雜且要求精細的手工操作步驟,使得臨床實驗室工作人員總在不斷追求操作步驟簡單的試劑,試劑生產廠家為滿足用戶的這種需求,也在努力追求操作簡單化,于是一些只需要簡單核酸提取或不需核酸提取、最少試劑配制的檢測試劑應時而生。如目前在國內廣泛使用的HBV DNA實時熒光PCR試劑。任何一件產品,如果生產過程只是追求簡單,則一定會以質量下降為代價。因此,國內的用于傳染病檢測的PCR試劑如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)和人類免疫缺陷病毒-1 RNA(HIV-1 RNA)定量檢測,與國外同類試劑盒相比較,一直存在重復性、分析敏感性和抗干擾(溶血、黃疸、脂血等)能力差等問題[1,2,3]。存在這些問題的最根本原因主要在于核酸提取,熒光PCR擴增階段的試劑水平與國外并無太大差距。臨床標本中可能存在血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、膽紅素、血脂等均是PCR擴增反應的抑制劑,是否能有效地將這些抑制物從標本中去除,決定了后續 的PCR擴增效率。核酸提取方法過于簡單,則無法將這些抑制物有效去除,直接影響后面的擴增檢測結果,影響上述檢測性能。而且,也因為這些抑制物的存在,無法在擴增檢測時加大樣本加入量。樣本加入量小,一是加樣的重復性和準確性都相對較差,最后會反映在整個檢測的重復性差;二是直接影響分析敏感性。作為PCR擴增來說,從理論上講,每個反應管內至少有1個分子,才會出現擴增,加樣量少,在標本內相應靶核酸含量少的情況下,則取得1個以上靶分子的可能性也小,反之越大。相對于傳染性病原體核酸檢測來說,人的基因檢測試劑在上述方面問題相對較少,因為人的基因含量高,一般不存在因標本中基因組含量少而影響檢測敏感性的問題,通常的核酸提取方法均可達到相應要求。
近年來,隨著藥物基因組學和腫瘤靶向治療等的研究進展,與個體化治療用藥相關的基因多態性、基因突變和基因量的變化等的檢測正迅速走向臨床應用。國內眾多廠家正在采用各種方法開發商品試劑,如基于實時熒光PCR的方法、PCR-雜交(硝酸纖維素膜、乳膠顆粒如Luminex、玻片如基因芯片等)、PCR-測序(雙脫氧測序、焦磷酸測序、新一代測序如Illumina、Ion torrent等)和PCR-高分辨熔點曲線分析(HRM)等,技術多種多樣,各有特點,有的對實驗室分區和操作人員的要求較高,對廣大基層實驗室來說,較難實際應用。因此,作為臨床實驗室如何判斷一種試劑方法能否有效地用于日常檢測,最重要的是在自己實驗室條件,對相應的試劑方法進行性能驗證,主要的性能指標有重復性、準確性、特異性、檢測限和抗干擾能力等,這些性能指標中最重要的是重復性,其是準確性的前提。評價重復性的1個簡單方法是,選擇不同強弱陽性及陰性的數份樣本進行20次批內和批間測定,看是否能得到相同的結果。如否,需尋找原因,排除實驗室環境條件及人員操作的因素,如果確認屬于試劑或方法的問題,則該試劑或方法就不具備臨床實用性,不能用于臨床檢測。
三、展望
隨著對人類基因及其結構改變、基因表達或表達產物代謝異常與疾病的發生、發展和藥物作用上的研究進展,分子診斷不只是涉及DNA和RNA,也涉及蛋白組學和代謝組學檢測。檢測方法學的進步,使得因疾病而改變的基因及其結構改變的譜、基因表達譜(RNA和蛋白譜)、代謝通路上的小分子譜的檢測變得容易,將出現一大批可用于臨床疾病診治的分子診斷標志物,使人類對疾病的認識,由點入面,最后得到1個清晰的全景圖像,治療成為有的放矢,使得患者疾病的治療進入到真正的個體化時代。 由上述可見,實驗室檢測尤其是分子診斷的準確性對于個體化醫學時代患者疾病的診治的重要意義。
1.方法學的更新換代
2.商品試劑與實驗室自配試劑
我國的臨床檢驗由完全的自配試劑進行日常檢測進入到依賴商品試劑盒,是從上世紀80年代末開始的,到90年代中后期,實驗室基本不再使用自配試劑。分子診斷不同于臨檢、生化、一般免疫分析等,其日常檢測量明顯較少,且一些特定的檢測項目如遺傳病和罕見疾病的分子診斷,病例數更少,這些疾病的分子診斷試劑是永遠也不可能有經過批準的商品試劑盒的,因此,就必須允許臨床實驗室自配試劑進行檢測。最重要的是,如果是自配試劑必須有自配試劑的標準操作程序(SOP),包括從原材料選擇及其每批質檢、試劑配制、試劑的性能驗證(重復性、準確性、特異性、檢測下限、抗干擾能力等)、每批試劑質檢方法等,最后形成的應是一個非商品試劑盒,從內到外應有商品試劑盒所具備的所有必要成分,并標明有效期。實驗室應保存該試劑制備的所有原材料購置、質檢和制備的實驗記錄。用于日常檢測時,應有嚴格的室內質量控制,如有室間質量評價,則應參加,如無,則應有實驗室間比對,以保證日常檢驗的質量。
3.實驗室檢測的自動化
隨著我國基礎工業的進步及下游工業的全球化,臨床分子診斷的自動化將逐步在國內的臨床實驗室應用。自動化首先將是在目前手工操作且對結果影響最大的核酸提取上實現,然后是結果的分析判斷,這方面軟件將起到最為關鍵的作用。當然最終目標,是實現從核酸提取到擴增檢測、結果報告全過程的自動化,國外一些廠家如羅氏、凱杰已實現了這一點,但對于國內企業來說,仍需要一個相當長的時間。
