1.原理

等電聚焦凝膠電泳是依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離的技術，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。

等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統（否則會導致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。

由于等電聚焦對蛋白質的電荷差異非常敏感，若要好的重復性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質化學組成和結構的修飾。另外，蛋白質－脂類、蛋白質－蛋白質相互作用可引起電荷改變，進而導致等電點遷移或紋理現象。除非特殊需要研究蛋白質－蛋白質相互作用或者必須保持蛋白質的生物學功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統中進行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。

2.主要儀器、試劑

儀器：微型電泳系統、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質、尿素、過硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三氯乙酸、考馬斯亮藍、甲醇、乙酸。
儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚藍；6）考馬斯亮藍染色液；7）考馬斯亮藍脫色液；

3.載體兩性電解質的選擇

載體兩性電解質是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質的配方：

4.灌膠

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來配置。

水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內（不要產生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前最好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。

注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發生聚合；2）現在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔最大上樣量大約15μl。

變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍：200μl

5.電泳

操作步驟：

1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質沉淀；2）用微量注射器將蛋白質樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。

電泳液：

1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；

2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。

等電聚焦電泳條件：

1）接好電極；

2）恒壓150V電泳30min；

3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。

6．電泳聚焦后處理

測定pH梯度：

1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；

2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3）測讀此KCl溶液的pH值、

凝膠的固定：

1）將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2）換成1%三氯乙酸溶液繼續浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍對載體兩性電解質的染色。

凝膠的染色：用考馬斯亮藍染色，然后脫色，制成干膠。

7.天然等電聚焦電泳的修正方案

如果要進行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；

1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；

2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；

3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。

8.常見問題及解釋

1） 若產生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。

2） 產生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應該注意凝膠的邊緣效應。

3） 蛋白帶的紋理現象是等電聚焦中經常遇到的問題，可能是一下原因：

a，蛋白質聚集或沉淀（尤其在等電點附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；

b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；

c，蛋白質修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導致蛋白質的氨甲酰化，預電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質樣品處理或儲存不當會發生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；

d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質或電極液不純或電極不潔凈也會產生波浪形條帶；

e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質濃度過低可導致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補充pH9－11的載體兩性電解質或進行非平衡pH梯度電泳；

f，染色時候高背景的產生可能由于固定后載體兩性電解質仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；

g，蛋白質條帶丟失或過淡可能由于蛋白質分子量較低（<10kDa〉或蛋白質在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；

h，復雜的蛋白質混合物等電聚焦后可以產生相互重疊的斑點，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進一步的蛋白質純化或免疫沉淀處理可以避免重疊斑點的產生。

9．其他要注意的事項

1）等電聚焦后可用一根染色的細線（0.1mm）標出染料前沿的位置；

2）不同品牌的載體兩性電解質性質上有細微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質凝膠時候蛋白質分離樣式略有差異，若要獲得最好的重復性一般不要更換載體兩性電解質的品牌；

3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；

4）由于電源和凝膠冷卻系統的限制，最長的凝膠長度為8－10cm，實際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；

5）當等電聚焦電泳時間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質不穩定造成的陰極漂移將成為嚴重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內聚焦蛋白質，但該方法不能用來測定蛋白質等電點。

6）尿素可以促進蛋白質溶解，并消除蛋白質－蛋白質及蛋白質－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質的等電點可能同天然蛋白有所差異。

7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質的相互作用極小。

8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；

9）超薄凝膠（50-500um）比常用標準等電聚焦更有優勢，因為高電場強度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。

10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質（>750kd）常常表現異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質。

11） 考馬斯亮藍染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質結合后可以更好的去除載體兩性電解質。

10.固相pH梯度等電聚焦電泳

簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術，其所用的介質是一些具有弱酸或弱堿性質的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質一端的雙鍵可以在聚合中共價結合到聚丙烯酰胺介質中，其另一端的R集團為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質pH梯度的區別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。