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Fluidigm 公司開發了一種在C1TM單細胞自動制備系統及BiomarkTM HD系統上檢測單細胞miRNA表達譜的實驗方案。此方案可以在小于24小時的時間內，平行處理96個單細胞，在一張GE 96.96芯片對每個單細胞分別檢測多達96種miRNA。配套的SINGuLAR™ 2.0分析軟件可以對數據進行非監督式聚類分析及PCA分析，有效的根據miRNA表達類型在單細胞水平揭示細胞群體的異質性，為研究miRNA調控提供更多數據。
使用自動化的微流控芯片系統在單細胞中檢測MicroRNA的異質性
Leyrat Anne, Shuga Joe, Li Nianzhen, Szpankowski Lukasz, Unger Marc & West Jay
（ISSCR 2013 poster: F-3201）
介紹
MicroRNA (miRNAs)是一類短小（18-24個核苷酸）的非編碼RNA，它們可以通過破壞信使RNA（mRNA）的穩定性和抑制mRNA翻譯來調控基因表達。細胞群體中miRNA的表達通常認為可以驅動下游基因表達和蛋白功能。我們的目的是使用一種微流控系統在單細胞水平確定miRNA表達的變化，這種系統可以自動化的將單細胞捕獲及miRNA預擴增以便進行后續表達分析。我們開發了一種簡單、模塊化的流程，可以將對細胞群體的分析輕松降至單細胞水平（圖1）。此流程包括兩個核心部件：C1TM單細胞自動制備系統（圖1a：樣本制備，包括細胞分離和從miRNA制備cDNA）和動態芯片（Dynamic Array™ IFC）及BiomarkTM HD系統（圖1b：讀出，高度平行的表達分析）。對C1TM芯片捕獲的每個單細胞進行的目標特異性擴增（Specific Target Amplification, STA），借用了Single Cell-to-Ct™試劑盒(Life Technologies)完成裂解及預擴增步驟，以及TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒(Life Technologies)完成逆轉錄步驟（圖2）。
使用動態芯片及BiomarkTM HD系統，可以使用96對microRNA TaqMan表達引物，平行分析從96個單細胞預擴增所得的96個cDNA樣本。使用Fluidigm SINGuLAR™ 2.0分析軟件對數據進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），揭示了從單一表型所得的一群單細胞中miRNA表達的顯著變化（圖3,4,5）。比較不同表型的細胞群體（人類胚胎成纖維細胞，人類誘導多能干細胞（iPS），從iPS所得人類神經祖細胞（NPC），以及完全分化的人類神經元（HN）），除同一類細胞之間表達的異質性外，展示了(不同類型細胞間)更巨大的差異。
結果
圖1. 在單細胞進行miRNA分析的整合流程
C1單細胞自動制備系統使用Life Technologies 開發的試劑和實驗方法（“Single-cell MicroRNA expression analysis”），對單細胞中的miRNA轉錄本進行目標特異性擴增（STA）。從將細胞懸液加至C1芯片到完成數據分析的整個流程，可以在不到24小時內完成。
圖2. C1 MicroRNA STA實驗流程
單細胞懸液（200-1000個細胞）被加入C1 IFC芯片的細胞進樣孔。使用來自Single Cell-to-Ct™試劑盒(Life Technologies)的裂解和預擴增試劑，以及來自TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒(Life Technologies)的逆轉錄試劑，進行逆轉錄（使用MegaplexTM RT pool）和預擴增（使用MegaplexTM PreAmp pool)，以便可以檢測每個單細胞中多達380種miRNA的表達。C1 IFC捕獲單細胞，然后沖洗，裂解，在反應倉平行對每個單細胞的miRNA進行逆轉錄和預擴增。96個預擴增過的樣本然后被導出，使用Biomark HD系統在一塊96.96動態芯片運行，研究每個樣本中多達96種miRNA的表達。
圖3. 分析：單個iPS細胞及其NPC后裔
(A) 對數據進行非監督式聚類分析可以清楚的區別開iPS細胞及使用小分子從iPS獲得的NPC后裔1. 同時揭示了每種細胞中的亞群。
(B) PCA清楚的揭示了這兩種表型不同的細胞群之間的差異。
(C) Violin Plot顯示了不同亞群中miRNA 的差異性表達，以及主成分1和2的主要貢獻者（左上至右下的順序）。iPS和NPC之間5種miRNA的表達變化，和使用microassay從胚胎干細胞（ES）及其NPC后裔得到的趨勢相同（未發表數據，Yao Shuyuan友情提供）。
圖4. 人類神經元，iPS和NPC細胞
(A) 對從iPS，NPC和成熟神經元（HN）獲得的數據進行非監督式聚類分析，可以清楚的將HN細胞從iPS和NPC細胞區分開，同時也揭示了每類細胞中存在的亞群。miR-9更頻繁且更高水平的在成熟神經元（HN）中表達。
(B) 根據miRNA表達，PCA可以清楚的區分這三類細胞。miR-20a，19b，17，和106a在HN中表達水平較低，符合基于神經分化和衰老數據的預期2,3。
圖5. 不同傳代數的胚胎成纖維細胞
(A) 對從兩個不同傳代數（P13和P24）獲得的BJ胚胎成纖維細胞得到的數據進行非監督式聚類分析，雖然可以揭示不同細胞間miRNA表達類型的不同，卻無法區分這兩種群體。
(B) 對從P13和P24細胞得到的miRNA表達數據進行PCA分析，進一步確認無法根據miRNA表達區分這兩群細胞。
(C) 當傳代數相距更遠（P7 對P24），對miRNA數據（熱圖未顯示）進行PCA分析可以區別他們。
結論
· 我們在C1TM單細胞自動制備系統開發了一種簡潔的實驗方案，能以最少的手工操作，在不到24小時內，平行處理高達96個單細胞，對其miRNA表達譜進行分析。
· C1 miRNA STA實驗方案使用了Life Technologies為miRNA優化過的試劑。特別的，Megaplex™ RT及PreAmp pool可以從C1 IFC上每個單細胞獲得多達380種不同miRNA的cDNA。使用Biomark系統，在96.96 GE動態芯片可以讀出表達類型。
· 對來自不同類型細胞的數據進行非監督式聚類分析及PCA分析，揭示了不同類型細胞之間、或者同一類型細胞中miRNA表達類型的差異（被microarray或者文獻所證實）。
參考文獻
1. Chambers SM, et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3), 275-280.
2. Trompeter H-I, Abbad H, Iwaniuk KM, Hafner M, Renwick N, et al. (2011) MicroRNAs MiR-17, MiR-20a, and MiR-106b Act in Concert to Modulate E2F Activity on Cell Cycle Arrest during Neuronal Lineage Differentiation of USSC. PLoS ONE 6(1): e16138. doi:10.1371/journal.pone.0016138
3. Hackl M., Brunner S., Fortschegger M., Laschober G.T., Micutkova L., et al. (2010), miR-17, miR-19b, miR-20a, and miR-106a are down-regulated in human aging. Aging Cell, 9(2), 291-296.
