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蛋白質組學技術分析方法及其儀器使用比較

   2025-05-16 www.eduienet.com1069
1 蛋白質組學概述
 
“蛋白質組”一詞的英文是Proteome,它是proteins 和genome 兩個詞的組合,意思是proteins expressed by a genome,即為基因組表達的蛋白質[1]。蛋白質組的概念是1994 年由Wilkins首先提出,并首次在1995 年7月的“Electrophoresis”上發表,指“一個細胞或一種組織基因組所表達的全部蛋白質”[2], 蛋白質組學(proteomics) 是從整體水平上研究細胞內蛋白質的組成及其活動規律。與基因固定不變的基因組不同,蛋白質組作為相應基因組所表達的產物隨時間、地點、環境等條件變化。在同一機體不同的組織和不同細胞中、蛋白質的種類、數量不同; 即使同一組織或細胞在不同的發育階段、生理狀態、甚至不同的外界環境下,其蛋白質組也是在不斷的變化之中; 在病理或治療過程中, 與正常生理過程也不同。因此, 蛋白質組是一個動態的概念。其目的是從整體的角度分析機體內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平、修飾狀態,了解蛋白質之間的相互作用和聯系, 揭示蛋白質功能與生命活動的規律。蛋白質組學的研究分為3 方面: (1) 蛋白質大規模鑒定和轉錄后修飾的微特征研究。(2) 差異顯示蛋白質組學,即蛋白質表達水平的研究, 對腫瘤等疾病的應用有著廣闊的前景。(3) 蛋白質間相互作用和翻譯后修飾的研究[3]。分析不同蛋白質的表達可用來比較正常組織和腫瘤組織之間的差別,蛋白組學將成為鑒別疾病的標記物,可以闡述某種機制,這種機制在越來越多的分析中被應用。人類的基因組比預期要小的多,并且基因組計劃中的腫瘤相關基因現在才被知道,然而較小的基因不能反映單一的蛋白質組。通常,廣泛的翻譯后修飾例如磷酸化、糖基化,蛋白水解處理作用都是很常見的方式。蛋白質翻譯后修飾能夠顯著地改變蛋白質的功能,因此可以表達出細胞和組織特征。因此,在基因組中,蛋白組學的挑戰之一就是通過蛋白效應器的知識理解組織特征,并且把它應用到臨床中。
 
2蛋白質組學分析方法
 
蛋白質組學可以利用蛋白微數列、電泳和質譜分析法檢測、識別和特征標記的蛋白進行分析。這些方法有其獨特的優點和局限性,根據各自能力評估蛋白質組譜。
2.1蛋白微數列技術
蛋白微數列是將大量抗體或者大量組織蛋白質樣品一次標記在載玻片上進行檢測分析。這種方法能夠檢測大量蛋白質的存在或者大量組織樣本表達的水平,但是這種技術在特異性和敏感性抗體的可用性方面是有限的。此外抗體的特異性必須通過免疫印跡證實,并且需要內部的對照,尤其是抗體的微數列沒有預測的親和力和特異性。盡管如此,大量商品化抗體的應用使得應用蛋白微數列成為可能。
2.2 雙向凝膠電泳
雙向電泳在1975年由O’Farrell發明,其原理是:第一向基于蛋白質的等電點不同,用等電聚焦分離.第二向則按分子質量的不同用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分離,這種方法尤其適用于分子量相似的蛋白質。采用蛋白質組重疊群 , 即利用多個不同pH梯度和分子量上相互重疊的2-DE 圖譜, 拼接成一張完整2-DE 圖譜, 大大提高了分辨率和進樣量, 這對于低豐度蛋白的檢出十分有利。個別蛋白質可以被染色水解為肽,這些可以通過質譜分析法進行分析。肽的酶解圖譜可以根據蛋白質的數據庫進行分析。
2.3 質譜分析法
蛋白組學主要的工具之一就是質譜分析法。這種方法是將基因轉變成氣體離子后,根據投料比例分析蛋白質。吸解作用和離子化技術例如基質輔助的激光解吸離子化技術,為檢測和分辨蛋白質提供了高水平的敏感度和精確度,這種技術的高敏感度和樣品的簡化使得這項技術便利化,但是它也存在局限性。分析復雜的樣品例如血清相比檢測蛋白困難大的多。
 
3 蛋白組學的分析儀器比較

方法
原理
優點
缺點
 
 
 
電泳
 
水溶性的蛋白根據電場的原理從負極向正級移動,移動的速率取決與其電荷、大小和形狀。
 
蛋白被識別之前凝膠劑肯定被染色,凝膠劑染色本身沒有用處,如果沒有另一種檢測技術的使用,諸如免疫印跡或者質譜分析技術,蛋白不能被精確地鑒別。
 
 
 
 
 
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳
 
 
 
蛋白質移行通過惰性聚丙烯酰胺凝膠,孔徑大小的可調節性可阻止蛋白,SDS是負電荷的洗滌劑,它可以展開蛋白質的分子鏈,成為游離的分子,蛋白質以不同的速率向正極移行。
 
 
 
 
分離所有類型的蛋白質,甚至那些非水溶性的蛋白質。
 
 
 
一維分離方法分離是有限的。接近傾向重疊,僅能解決小分子量的蛋白質。
 
 
 
 
二維凝膠電泳
 
 
第 1 相電泳是根據蛋白質的等電點不同在p H 梯度膠中進行等電聚焦電泳。第 2 相電泳根據蛋白質等電聚焦的原理,根據蛋白質分子量的大小在凝 膠 電 泳 ( SDS-PAGE)進行蛋白質分離 。
 
同多種蛋白凝膠電泳相比,這種方法分離混合物分辨率高,根據圖像分析比較便利,蛋白質分解的大約每毫升1ng。
高豐度蛋白存在可能是模糊的(例如白蛋白、免疫球蛋白)低豐度蛋白的分離蛋白質需要從凝膠中移除斑點,消化,利用質譜分析法分析肽,它不能分辨小分子重的蛋白質(<10,000 Da)。不能順從多變的分析。
 
 
 
 
 
 
二維熒光差異凝膠電泳
 
 
二維電泳使用不同的青藍燃料從不同的樣品中標記蛋白,在不同的光的波長發生酶倍增免疫測定技術,混合樣品中達到三種的樣品能夠被標記(測試、對照、參考)
從混合物中分析不同的蛋白質這種方法很簡單,在單一的凝膠中可以得到蛋白質表達的速率,在每一個凝膠或者是不同凝膠之間變化的復位由一個內部的標準,非常敏感。
高豐度蛋白存在可能是模糊的(例如白蛋白、免疫球蛋白)低豐度蛋白分離蛋白質最終需要從凝膠中移除斑點,消化,利用質譜分析法分析肽,許多斑點不能辨別,因為材料的缺乏,它不能分辨小分子重的蛋白質(<10,000 Da)。
 
蛋白質芯片多種蛋白質的芯片、細胞因子芯片、組織微數列
已知的蛋白質局限到一個表面(念珠、硝酸纖維素),利用免疫測定的原理檢測。
高敏感率和處理量,多種分析物可以同時測定。
有限抗體的有效性和特異性需要一些先前蛋白質表達的知識。可能不能檢測分析亞型。
 
 
 
 
 
 
基質輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質譜技術
 
 
 
決定蛋白質或者肽片段的精確積聚。蛋白質或肽片段是由有機酸間質混合而成的,在金屬載玻片上干燥,激光離子化破壞肽類片段, 這可以使得在電場中向檢測器方向移動。到達檢測器的時間取決于電荷和形狀。通過質譜分析技術可以獲得肽類的遺傳信息。
 
最大的測定分子量<3000Da
 
 
 
 
 
蛋白質芯片表面增強激光解析電離-飛行時間-質譜技術
 
 
與基質輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質譜技術比較,不同點在于它使用了色譜技術,從復雜試樣中,有選擇的結合蛋白質亞型。
沖洗移去表面非特異性凝結蛋白質和其他物質,這些物質可以干擾離子化的進程。(鹽,去污劑等)
 
 
 
 
高流通量病毒免疫測定自動化;樣本量最小;初步分離原材料可以增強低豐度蛋白的檢出率。
 
不能直接辨別蛋白質。對高分子量蛋白質(分子量>20 kDa)不敏感。
 
 
 
 
穩定同位素標記
 
 
生物樣本使用不同的穩定同位素,這些同位素使用變調劑靶向于一種特異性的氨基酸。介于分離和質譜分析法之后,兩個不同樣本的肽在不同質量單位的特異同位素中使用,能獲得相對量化。
 
 
蛋白組學比其他方法普及。在大量的蛋白質中能獲得度量信息。通常能獲得相關蛋白的識別數據信號。
高技術要求,低處理能力。樣本在檢驗前需經過胰蛋白酶處理。這種可靠的方法適合于檢測大量蛋白質。


 
標簽: 蛋白質組學
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